根據《醫療器械監督管理條例》《體外診斷試劑注冊管理辦法》，“組織體外診斷試劑國家標準品、參考品的制備和標定工作”的責任主體為中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）。

目前，中檢院可以提供113種注冊檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品，其中有8種人類基因檢測相關試劑評價國家參考品。另外，中檢院還正在開展如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測參考品、單倍型基因組DNA參考品、流產組織拷貝數變異檢測參考品、HLA分型參考品及脆性X綜合征FMR1基因突變參考品等人類基因檢測相關試劑評價國家參考品的研制工作。

為進一步規范這類體外診斷試劑標準物質的研制工作，筆者對人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質研制過程中的一般技術要求進行了梳理，供業內同仁交流探討。

參考物質原料選擇及確證

人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質通常由檢測基因位點陽性參考品（有時也稱為突變陽性參考品）、檢測基因位點陰性參考品（有時也稱為野生型以及其他同源基因位點陽性參考品）、檢測限參考品及精密性參考品等組成，用于全面控制診斷試劑的質量。

陽性參考品用來控制試劑的陽性符合率，由一定數量的陽性樣品組成。通常是從大量樣品中根據不同目的篩選出來，要求盡可能覆蓋靶基因多種等位基因或突變類型，應具有代表性、滿足臨床樣本的分布類型、地域或民族等群體遺傳

標記代表性，并經過確證。同時，還可以根據需求采用相應基因突變的永生化淋巴細胞系、基因編輯突變細胞系等。

陰性參考品用來控制試劑的陰性符合率，由一定數量的陰性樣品組成。通常來自檢測靶基因野生型或其他突變類型人群樣本、同源基因位點陽性人群樣品和（或）易產生交叉反應的樣品。為了控制試劑的非特異反應，并和陽性參考品一致，根據試劑檢測樣本類型，應考慮陰性參考品的基質，并逐一確證。同時，陰性參考品也可以根據需求采用特定基因野生型或相關基因突變類型明確的永生化淋巴細胞系、基因編輯突變細胞系等。

檢測限參考品通常由一份或多份經過確證的稀釋陽性樣品組成，用來控制試劑的檢測限，即試劑所能檢出的樣品中陽性物質的最低限度。檢測限參考品設置應根據試劑的臨床預期用途進行合理設立，如臨床預期用途為靶向藥物指導的檢測試劑，其檢測限參考品設置建議和臨床治療以及臨床樣本中的實際分布相關聯，并采用具有藥效相關的濃度和比例進行設置。同時，建議設置多個梯度，主要從核酸濃度和突變所占百分比兩個方面進行評價。

精密性參考品通常由一份或幾份經過確證的陽性樣品組成，用來控制試劑的重復性，建議包括弱陽性、中陽性或強陽性水平的精密度驗證；必要時設置陰性參考品重復性驗證。

參考物質的制備和標定

在制備人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質時，應根據其品種要求進行配制、稀釋、分裝、凍存，必要時進行凍干熔封。

通常，人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質一般采用液體冰凍的方式保存，不需要進行凍干操作。在稀釋過程中，應對稀釋液進行充分驗證。稀釋液一般采用的是TE溶液、去核酸酶水以及野生型基因組DNA溶液、處理后的臨床樣本等。稀釋液的選擇應保證不干擾后續檢測、有助于更好地模擬臨床樣本，并不對參考品的濃度定量和/或比例確定造成干擾。

而凍干一般需加保護劑等物質，該類物質應對參考物質的特性量值、穩定性和試驗操作過程無影響，并且其本身在干燥時不揮發。需要干燥保存的，應在分裝后立即進行凍干和熔封。凍干的水分含量應不高于3.0％。整個分裝、凍干和熔封過程，應保證對各安瓿間主要指標和穩定性的一致性不產生影響。

在對人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質進行標定時，應首先確定是否有國際標準品或參考品，如果有，以其作為標準標定待制備的參考物質；如果沒有，則依據相關標準、指南、規范或其他經過驗證的方法來制定該參考物質的定值方案和方法。為保證新研制參考品的適用性，在選擇參與協作標定的試劑盒時，應注意其技術原理、試劑盒生產企業的代表性及覆蓋面，以確定其在實際工作中的適用情況。

人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質主要控制的指標有陰陽性符合率、檢測限及重復性等，不同類型的人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質，對這些指標的考核標準也不盡相同，應依據各種人類基因檢測相關試劑的特點建

立其相應的考核標準。

參考物質的穩定性研究

人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質穩定性研究可采用適宜方式進行，如經驗資料或進行加速破壞試驗。進行加速破壞試驗時，一般根據制品性質放置不同溫度、不同時間來測定考核指標，以評估其穩定性。

參考物質建立后，還應定期進行期間核查，觀察其穩定性；同時，還應對其反復凍融穩定性進行考察。根據國際慣例，目前人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質不設“有效期”，由中檢院對標準物質進行定期監測。

負責人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質研制工作的實驗室在工作完成后，還要經過嚴格的審評審批，獲得簽批的標準品應進行貼標簽及外包裝工作，標簽內容一般包括中文名稱、批號及標識量，超出規定用途時，使用者應對標準物質的適用性負責。

該類標準物質的貯存條件應有利于基因特性的穩定，通常為低溫冷凍保存，對貯存情況應定期檢查并記錄。對于某些有特殊貯存要求的，應有特殊的貯存措施，并應在標簽與使用說明書中注明。

人類基因檢測相關試劑評價國家參考物質應有專人負責保管和發放，由中檢院直接提供給各生產單位標定其工作參考品或用于產品檢定。

（摘編自《中國藥事》2018年8月第32卷第8期，作者：曹麗梅 王一平 袁偉媛 黃杰）